РАЗРАБОТКА ТКАНЕИНЖЕНЕРНОЙ КОНСТРУКЦИИ НА ОСНОВЕ ОБЪЕМООБРАЗУЮЩЕГО ПРЕПАРАТА URODEX® ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ СТРЕССОВОГО НЕДЕРЖАНИЯ МОЧИ У ЖЕНЩИН

И.В. Арутюнян1,2, Т.Х. Фатхудинов1,2,3, А.В. Макаров1,2, Т.А. Тетерина1, Е.Ю. Кананыхина1,2, А.В. Ельчанинов1,2,3,, А.А. Ким3, О.А. Васюкова3, Е.Е. Кириенко1,2, Э.Ш. Раимова3, С.В. Павлович1, И.А. Аполихина1, Г.Т. Сухих1

1 – ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова» Минздрава России, Москва, Россия

2 – ФГБУ «Научно-исследовательский институт морфологии человека» РАМН, Москва, Россия

3 – ГБОУ ВПО Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И.Пирогова, Москва, Россия

    Резюме: Объемообразующий препарат UroDex® может быть перспективным носителем при разработке тканеинженерной конструкции для лечения стрессового недержания мочи у женщин, так как по своим физико-химическим свойствам он близок к микроносителям для масштабирования клеточных культур. Созданная на его основе инъекционная форма тканеинженерной конструкции с использованием стромальных клеток потенциально способна усилить и пролонгировать терапевтический эффект препарата. Проведенное исследование показало, что UroDex® стабилен в условиях культивирования, не цитотоксичен, обладает высокими адгезионными свойствами по отношению к стромальным клеткам и способен обеспечить выживаемость клеточного компонента конструкции при трансплантации. Полученные нами данные подтверждают возможность использования UroDex® в качестве микроносителя для тканевой инженерии.

 

Сведения об авторах:

 Арутюнян Ирина Владимировна, научный сотрудник ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова Минздрава России, научный сотрудник ФГБУ НИИМЧ РАМН

 

Фатхудинов Тимур Хайсамудинович, доктор медицинских наук, заведующий лабораторией регенеративной медицины ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова Минздрава России, ведущий научный сотрудник ФГБУ НИИМЧ РАМН

 

Макаров Андрей Витальевич, кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова Минздрава России, ведущий научный сотрудник ФГБУ НИИМЧ РАМН

 

Тетерина Татьяна Александровна, аспирант ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова Минздрава России

 

Кананыхина Евгения Юрьевна, младший научный сотрудник ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова Минздрава России, младший научный сотрудник ФГБУ НИИМЧ РАМН

 

Ельчанинов Андрей Владимирович, научный сотрудник ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова Минздрава России, старший научный сотрудник ФГБУ НИИМЧ РАМН

А.А. Ким3,

 О.А. Васюкова3,

 Е.Е. Кириенко1,2,

Э.Ш. Раимова3,

С.В. Павлович1

Аполихина Инна Анатольевна, доктор медицинских наук, профессор кафедры акушерства, гинекологии, перинатологии и репродуктологии ФППОВ ПМГМУ им. И.М. Сеченова, руководитель гинекологического отделения восстановительного лечения и стационара дневного пребывания ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова Минздрава России

Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (495) 735-10-55. E-mail: apolikhina@inbox.ru

 

Сухих Геннадий Тихонович, академик Российской академии медицинских наук, доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки Российской Федерации, директор ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова Минздрава России, заведующий кафедрой акушерства, гинекологии, перинатологии и репродуктологии ФППОВ ПМГМУ им. И.М. Сеченова

 

 

Недержание мочи у женщин является одной из самых частых и до конца не решенных проблем современной урогинекологии. Данное заболевание значительно ухудшает качество жизни пациентов, зачастую приводя к социальной дезадаптации. Распространенность недержания мочи у женщин по данным эпидемиологических исследований значительна: проблемы с удержанием мочи испытывают до 25% молодых женщин, от 44 до 57% женщин в постменопаузе и до 75% женщин старшего возрастной группы [1].

Поиск новых методов лечения стрессового недержания мочи (наиболее распространенной формы) не прекращается: по данным интернет-ресурса www.clinicaltrials.govна сегодняшний день зарегистрировано 189 клинических исследований в этой области [2]. Наряду с консервативным подходом (прием фармпрепаратов, физические упражнения, электроакупунктура и физиотерапия), применяется также хирургическое лечение. Большая часть зарегистрированных FDA исследований посвящены изучению безопасности и эффективности слинговых операции («поддерживание» уретры с помощью петли из синтетических материалов). Вторым по распространенности хирургическим методом лечения стрессового недержания мочи является введение объемообразующих препаратов (англ. “bulkingagent”), который в силу своей малой инвазивности обладает рядом преимуществ: меньший риск инфицирования и формирования рубцов, лучшая переносимость пациенткой, более доступная цена. Достаточное разнообразие объемообразующих препаратов, представленных на современном рынке медицинских услуг, дает возможность выбора продукта в зависимости от заявленных производителем характеристик (таблица 1). В то же время вышеописанные хирургические методы лечения недержания мочи не всегда эффективны и могут требовать проведения повторных вмешательств [3, 4].

Новейшим направлением в лечении стрессового недержания мочи можно считать применение клеточных технологий. В экспериментальных исследованиях продемонстрирована высокая эффективность трансплантации клеток в периуретральную область на модели стрессового недержания мочи лабораторных животных [5, 6]. По состоянию на июнь 2013 года в FDAзарегистрировано 8 подобных клинических исследований, касающихся изучения безопасности и эффективности введения скелетных миобластов или мультипотентных стромальных клеток [2]. Предварительные результаты этих исследований свидетельствуют о безопасности и эффективности данных подходов [7, 8].

Следующим этапом развития этих технологий, несомненно, должно стать введение не суспензионных клеточных культур, а тканеинженерных конструкций, которые могут обеспечить более высокую выживаемость клеточного компонента и его иммобилизацию в области введения [9]. Оптимальной с этой точки зрения представляется комбинация объемообразующего препарата и стромальных клеток. Выбор носителя может быть обусловлен его максимальным приближением к микроносителям, которые широко применяют для масштабирования клеточных культур. Сравнительная характеристика наиболее часто применяемых клеточными технологами микроносителей приведена в таблице 2.

Как видно из таблиц 1 и 2, наибольшим сходством обладают объемообразующий препарат UroDex® и универсальный микроноситель Cytodex 1™. Обращает на себя внимание только меньший диаметр декстрановых гранул в UroDex® (80-120 мкм) и наличие в нем гиалуроновой кислоты в качестве несущего геля. Однако в литературе представлены данные о возможности выживания стромальных клеток на поверхности декстрановых гранул диаметром 80 мкм в присутствии гиалуроновой кислоты по меньшей мере в течение 12 часов [10].

Возникает также вопрос о влиянии диэтиламиноэтил-декстраномера (DEAE-декстраномера) в качестве подложки на свойства клеточного компонента конструкции. В недавно опубликованной работе было продемонстрировано, что культивирование на микроносителе из DEAE-декстраномера не влияет на профиль экспрессии поверхностных антигенов, клоногенную активность и время удвоения популяции даже у таких чувствительных культур как мезенхимальные стволовые клетки фетального костного мозга [11].

Таким образом, состав объемобразующего препарата UroDex® (положительно-заряженные за счет DEAE-групп декстрановые гранулы, нетоксичная гиалуроновая кислота в качестве геля-носителя), удобная форма выпуска и медицинское назначение делают его оптимальным для создания инъекционной формы тканеинженерной конструкции и ее последующего применения в области урогинекологии. В то же время данные о подобных исследованиях в современной литературе отсутствуют. В настоящей работе представлены результаты нашего исследования о возможности использования UroDex® в качестве микроносителя для тканевой инженерии.

 

Материалы и методы

Выделение и характеристика мультипотентных стромальных клеток

Мультипотентные стромальные клетки (МСК) выделяли из жировой ткани (липоаспирата) или вартонова студня человека путем ферментативной обработки с помощью коллагеназы Iи IIтипов. Клетки культивировали в ростовой среде DMEM/F12 (ПанЭко, Россия) с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки до 10% (PAALaboratories, США). Принадлежность выделенных клеток к МСК подтверждали в соответствии с требованиями ISCT [12]. Для дифференцировки в адипогенном, остеогенном и хондрогенном направлениях использовали готовые дифференцировочные среды StemPro® AdipogenesisDifferentiationKit, StemPro® OsteogenesisDifferentiationKit, StemPro® ChondrogenesisDifferentiationKit (Gibco, США). Дифференцировку клеток верифицировали с помощью общепринятых гистохимических методов с использованием Судана III (адипогенез), ализаринового красного S(остеогенез) или альцианового синего (хондрогенез). Для иммунофенотипирования использовали набор антител Human MSC Analysis Kit (BDBiosciences, США). Анализ проб проводили на проточном цитофлуориметре FC 500 (BeckmanCoulter, США) с программным обеспечением CXP 2.2.

 

Оценка стабильности препарата URODEX® в культуральной среде

Для оценки стабильности препарат UroDex® смешивали с культуральной средой в пропорции 1:1 или 1:10 и инкубировали в течение 7 суток при 37°С. Дополнительно оценивали стабильность препарата в культуральной среде в течение длительного времени (6 месяцев) при 4°С. Целостность компонентов препарат UroDex® исследовали с помощью световой микроскопии (Axiovert 40 CFL(Zeiss, Германия)).

 

Оценка цитотоксичности препарата URODEX®

Цитотоксичность препарата UroDex® оценивали с помощью МТТ-теста. Для тестирования использовали МСК третьего пассажа. Клетки рассаживали в 96-луночные планшеты (NUNC, Дания) из расчета 5 тысяч клеток на лунку. После прикрепления клеток в каждую лунку вносили образец UroDex® и инкубировали в течение 2 или 7 суток в стандартных культуральных условиях. После инкубации образцы удаляли, в каждую лунку добавляли 20 мкл стокового раствора МТТ (ПанЭко, Россия) (50 мг/мкл) и инкубировали в течение 2-х часов при 37°С, контролируя развитие окраски. Реакцию останавливали, удаляя среду с МТТ. Для элюирования формазана добавляли ДМСО (ПанЭко, Россия) и помещали планшет на шейкер (режим 200 об/мин, 20 мин). Оптическую плотность элюата измеряли при длине волны 540 нм, фоновое значение – при 620 нм. В качестве контроля использовали лунки с клетками без внесения UroDex®. Измерение проводили на плашечном спектрофотометре Fluoroscan Ascent (Labsystems Oy, Финляндия).

 

Соединение клеточного компонента и микроносителя

МСК жировой ткани или пупочного канатика открепляли от подложки стандартным методом с помощью раствора трипсина-ЭДТА (ПанЭко, Россия) и осаждали центрифугированием (1100 об/мин, 10мин). Осадок ресуспендировали в ростовой среде в концентрации 5 млн клеток в 1 мл и смешивали с равным объемом препарата UroDex®. Полученную суспензию переносили в стандартную культуральную посуду из полистирола или в посуду с низкими адгезивными свойствами из полипропилена (NUNC, Дания). Для оценки количества адгезированных на поверхности носителя клеток их ядра докрашивали DAPI(Sigma-Aldrich, США). Наблюдение осуществляли с помощью инвертированного микроскопа Axiovert 40 CFL(Zeiss, Германия) и программного обеспечения AxioVisionRel.4.8.

 

Оценка выживаемости клеток в условиях, имитирующих трансплантацию

Суспензию UroDex® с адгезированными клетками отмывали от культуральной среды, переносили в физиологический раствор (ПанЭко, Россия) и пропускали через иглу 20G (внутренний диаметр иглы 603 мкм). Для выявления живых и погибших клеток суспензию окрашивали 0,4% трипановым синим (ПанЭко, Россия).

 

Результаты

Выделение и характеристика мультипотентных стромальных клеток

Выделенные из липоаспирата или пупочного канатика человека клеточные культуры имели характерный для мультипотентных стромальных клеток фенотип. На 3 пассаже более 96% клеток экспрессировали положительные для МСК маркеры CD90, CD73 и CD105, менее 2% — негативные маркеры CD11b, CD19, CD34, CD45 и HLA-DR. Клеточные культуры ответили на действие индукторов дифференцировки: липидные включения в цитоплазме в процессе адипогенеза появлялись на 5-7 сутки индукции, отложения мукополисахаридов при хондрогенезе или кальцификатов при остеогенезе фиксировали к концу 3 недели индукции.

 

Оценка стабильности препарата UroDex® в культуральной среде

При смешивании препарата UroDex® с культуральной средой наблюдали окрашивание декстрановых гранул, но не гиалуронового носителя красителем PhenolRed, входящим в состав среды и являющимся индикатором уровня рН (рис. 1а, 1б). Помимо окрашивания никаких видимых изменений в течение 7 суток инкубирования при 37°С не обнаруживали.

При длительной (6 месяцев) инкубации UroDex® в культуральной среде при 4°С выявляли отдельные очаги резорбции гиалуронового носителя, пластины которого распадались на небольшие фрагменты (рис. 1в). При этом сами декстрановые гранулы не изменялись, сохраняя форму и характерный рисунок поверхности (рис. 1г).

 

Оценка цитотоксичности препарата UroDex®

Проведенный МТТ-тест показал отсутствие цитотоксичности препарата UroDex® по отношению к МСК пупочного канатика и МСК жировой ткани человека. Даже через 7 суток количество живых клеток по сравнению с контролем снижалось незначительно (рис. 2.).

 

Соединение клеточного компонента и микроносителя

При смешивании суспензии клеток и препарата UroDex® наблюдали адгезию клеток к поверхности декстрановых гранул и пластинам гиалуроновой кислоты (рис. 3а, 3б).

Перенос соединенных компонентов в стандартную культуральную посуду из полистирола приводил к тому, что клетки прикреплялись к плоской подложке, увлекая за собой декстрановые гранулы (рис. 4а). Дальнейшее культивирование приводило к образованию скоплений, состоящих из нескольких клеточных слоев и декстрановых гранул, при этом фрагменты гиалуроновой кислоты, вероятно, были резорбированы (рис. 4б). Такое взаимное притяжение обусловлено наличием на поверхности декстрановых гранул положительно заряженных DEAE-групп и отрицательного заряда на клеточной мембране.

Культивирование в посуде из полипропилена с низкими адгезионными свойствами позволяло сохранить клетки на поверхности декстрановых гранул (рис. 5а). Стоит отметить, что распластывание клеток мы наблюдали только на поверхности декстрановых гранул, но не на пластинах гиалуроновой кислоты. Количество прикрепленных клеток с помощью световой микроскопии было определить достаточно сложно, так как клетки располагались на сферическом носителе. Подсчет клеточных ядер, окрашенных DAPI, показал, что на одной единице носителя располагалось 17,5±8,1  клеток (рис. 5б). Более длительное культивирование (более 5 суток), однако, также приводило к образованию достаточно крупных конгломератов (рис. 5в).

 

Оценка выживаемости клеток в условиях, имитирующих трансплантацию

Пропускание отмытой от культуральной среды суспензии UroDex® с адгезированными клетками через иглу 20Gне приводило к гибели клеток. При окрашивании 0,4% трипановым синим декстрановые гранулы адсорбировали краситель, клетки же оставались неокрашенными. При этом часть поверхности гранул в процессе развития окраски и после ее завершения оставалась более светлой, так как прикрепленные клетки препятствовали проникновению красителя (рис. 6а, 6б).

Заключение

Результаты проведенного нами исследования показывают, что объемообразующий препарат UroDex® обладает свойствами, позволяющими использовать его в качестве инъекционного микроносителя для тканевой инженерии:

1)    достаточная стабильность в условиях культивирования;

2)    отсутствие цитотоксичности по отношению к мультипотентным стромальным клеткам;

3)    эффективная адгезия клеток;

4)    механические свойства, обеспечивающие выживаемость прикрепленных клеток при трансплантации.

В то же время использование данного микроносителя имеет ряд технологических особенностей:

1)    высокие сорбционные свойства декстрановых гранул не допускают использования в процессе культивирования сред с добавлением красителей;

2)    возможность образования конгломератов клеток и гранул задает достаточно узкие временные рамки процесса культивирования.

Разработанная на основе UroDex® инъекционная форма тканеинженерной конструкции теоретически может значительно увеличить и пролонгировать эффект применения препарата в моноварианте за счет дополнительного воздействия клеточного компонента на регенеративные процессы в периуретральной области. Следующим этапом нашей работы станет оценка безопасности и эффективности разработанной конструкции на экспериментальной модели стрессового недержания мочи invivo.

 

Работа выполнена при финансировании Министерством образования и науки Российской Федерации в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009 – 2013 гг. (соглашение № 8068).


Таблица 1. Сравнительная характеристика наиболее распространенных объемообразующих препаратов для лечения стрессового недержания мочи у женщин.

Продукт,

производитель

Форма размер и частиц

Состав частиц

Несущий гель

Особенности

Contigen®,

C.R. Bard, Inc.

ацеллюлярный деградируемый дериват коллагена бычьей дермы, химически подшитый глутаровым альдегидом

резорбируемый, эталон для сравнения при регистрации FDA

Macroplastique®

Uroplasty, Inc.

частицы неправильной формы 50-600 мкм

силиконвый эластомер полидиметилсилоксана (PDMS)

поливинилпиролидоновый (PVP) гель

нерезорбируемый, гибкий, биосовместимый, высокотекстурированный имплант

Coaptite®

BioForm Medical, Inc.

округлые частицы 75-125 мкм

кальций гидроксиапатит

Натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы

резорбируемый, гель быстро замещается клетками

URYX®

Urethral Bulking Agent (Tegress®)

Genyx Medical, Inc.

нет данных

сополимер этилена и винилового спирта (EVOH)

диметилсульфоксид (DMSO)

нерезорбируемый, продажа прекращена (осложнения – эрозия у 16% пациентов)

Durasphere® EXP

Boston ScientificCorporation

округлые частицы 250-300 мкм

оксид циркония, покрытый углеродом

глюкановый гель на водной основе

разработан для терапии недостаточности сфинктера уретры

UroDex®

BioPolymer GmbH & Co.

округлые частицы 80-120 мкм

декстраномер (DEAE Sephadex A 25)

поперечно-сшитая гиалуроновая кислота неживотного происхождения

резорбируемый, неиммуногенный, биосовместимый

 


Таблица 2. Сравнительная характеристика наиболее распространенных микроносителей для клеточных культур.

Продукт,

производитель

Форма и размер частиц

Состав частиц

Поверхностный заряд

Особенности

Cytodex 1™,

GE Healthcare

округлые частицы диаметром

190 мкм

(147-248 мкм)

DEAE-декстран

положительный

универсальный носитель, подходит для большинства клеточных линий и первичных культур

Cytodex 3™,

GE Healthcare

округлые частицы диаметром

175 мкм

(141-211 мкм)

декстран, покрытый желатином, полученным из кожи свиньи

нет

разработан для труднокультивируемых клеток и эпителиальных клеток

Cytoline 1™,

GE Healthcare

удлиненные частицы толщиной

400-1100 мкм,

длиной

1700-2500 мкм, поры 10-400 мкм

полиэтилен и кремний

слабый отрицательный

крупные размеры, высокая ригидность, разработан для линии СНО

Cytopore1™,

GE Healthcare

округлые частицы диаметром

230 мкм

(200-280 мкм), поры 30 мкм

DEAE-целлюлоза

положительный

разработан для линии СНО

Cytopore 2™,

GE Healthcare

округлые частицы диаметром

230 мкм

(200-280 мкм), поры 30 мкм

DEAE-целлюлоза

сильный положительный

разработан для клеток, требовательных к положительно заряженной поверхности

HyQ CultiSpher, Thermo Scientific

округлые частицы диаметром

130-380 мкм, поры 20 мкм

свиной желатин

нет

уникальный белковый носитель

HyQSphere Microcarriers,

Thermo Scientific

округлые частицы диаметром

160-180 мкм

Полистирен, поверхность модифицирована катионными группами или белками внеклеточного матрикса

зависит от покрытия

подходят для самых разнообразных клеточных типов благодаря возможности выбора покрытия

Microcarriers

(SoloHill)

округлые частицы диаметром

90-300 мкм

Полистирен, поверхность модифицирована катионными группами или белками внеклеточного матрикса

Зависит от покрытия

стабильны до 13 недель в биореакторе, подходят для самых разнообразных клеточных типов благодаря возможности выбора покрытия

 


Литература

  1. Shamliyan T, Wyman J, Bliss D, Kane R, Wilt T. Prevention of Urinary and Fecal Incontinence in Adults. Evidence Reports/Technology Assessments, No. 161. Rockville (MD): Agency for Healthcare Research and Quality (US); December 2007. Report No.: 08-E003.
  2. http://www.clinicaltrials.gov/ct2/results?term=stress+urinary+incontinence&Search=Search
  3. Stavros C, Ioannis V, Vasileios SI, Gkotsi ACh, Georgios S, Papathanasiou A et al. Comparison of TVT, TVT-O/TOT and mini slings for the treatment of female stress urinary incontinence: 30 months follow up in 531 patients. Arch Ital Urol Androl. 2012; 84(3): 129-36.
  4. Reynolds WS, Dmochowski RR. Urethral bulking: a urology perspective. Urol Clin North Am. 2012; 39(3): 279-87. doi: 10.1016/j.ucl.2012.05.002.
  5. Li GY, Zhou F, Gong YQ, Cui WS, Yuan YM, Song WD et al. Activation of VEGF and ERK1/2 and improvement of urethral function by adipose-derived stem cells in a rat stress urinary incontinence model. Urology. 2012; 80(4): 953.e1-8. doi: 10.1016/j.urology.2012.05.030.
  6. Lin CS, Lue TF. Stem cell therapy for stress urinary incontinence: a critical review. Stem Cells Dev. 2012; 21(6): 834-43. doi: 10.1089/scd.2011.0621.
  7. Strasser H, Marksteiner R, Margreiter E, Pinggera GM, Mitterberger M, Frauscher F et al. Autologous myoblasts and fibroblasts versus collagen for treatment of stress urinary incontinence in women: a randomised controlled trial. Lancet. 2007; 369(9580): 2179-86.
  8. Ho CP, Bhatia NN. Development of stem cell therapy for stress urinary incontinence. Curr Opin Obstet Gynecol. 2012; 24(5): 311-7. doi: 10.1097/GCO.0b013e328357ae03.
  9. Макаров А.В., Тетерина Т.А., Саидова А.С., Арутюнян И.В., Фатхудинов Т.Х., Аполихина И.А., Сухих Г.Т. Клеточные технологии в лечении стрессового недержания мочи у женщин. Акушерство и гинекология. 2012;8(2), 53-59.
  10. Kim BS, Choi JS, Kim JD, Yeo TY, Cho YW. Improvement of stem cell viability in hyaluronic acid hydrogels using dextran microspheres. J Biomater Sci Polym Ed. 2010; 21(13): 1701-11. doi: 10.1163/092050609X12548957288848.
  11. Goh TK, Zhang ZY, Chen AK, Reuveny S, Choolani M, Chan JK et al. Microcarrier culture for efficient expansion and osteogenic differentiation of human fetal mesenchymal stem cells. Biores Open Access. 2013; 2(2): 84-97. doi: 10.1089/biores.2013.0001.
  12. Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, Slaper-Cortenbach I, Marini F, Krause D et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 2006; 8(4): 315-7.

Рисунки



Рис. 1а



Рис. 1б



Рис. 1в



Рис. 1г


Рисунок 1. Внешний вид URODEX® при смешивании с культуральной средой. А — URODEX®/среда 1 к 1, инкубация 7 суток при 37°С. ФК, х50. Б — URODEX®/среда 1 к 10, инкубация 7 суток при 37°С. ФК, х50. В — URODEX®/среда 1 к 3, инкубация 6 месяцев при 4 °С. ФК, х50. Г — URODEX®/среда 1 к 3, инкубация 6 месяцев при 4 °С. ФК, х200.



Рисунок 2. Результаты МТТ-теста «Оценка цитотоксичности URODEX® по отношению к МСК пупочного канатика».


Рис. 3а



Рис. 3б

Рисунок 3. Адгезия клеток к UroDex®, 0 часов инкубации. ФК. А — х50. Б — х200.

 
Рис. 4а


Рис. 4б

Рисунок 4. Прикрепление гранул UroDex® и клеток к подложке при культивировании в стандартной посуде из полистирола. А — 2 сутки инкубации. ФК, х50. Б — 5 сутки инкубации, образование конгломератов. ФК, х50.



Рис. 5а


Рис. 5б


Рис. 5в

Рисунок 5. Культивирование клеток на UroDex® в посуде с низкими адгезионными свойствами из полипропилена. А — обрастание клетками декстрановых гранул, 2 сутки культивирования. ФК, х200. Б — окрашенные DAPIядра клеток на поверхности гранул. Флуоресцентная микроскопия, х200. В — образование конгломератов, 5 сутки культивирования. ФК, х200.


Рис. 6а


Рис. 6б

Рисунок 6. Выживаемость клеток на UroDex® в условиях, имитирующих трансплантацию. Окрашивание 0,4% трипановым синим. А — развитие окраски. ФК, х400. Б — неокрашенные живые клетки на поверхности декстрановых гранул. ФК, х400.